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1.  麻醉

1)  用麻药如戊巴比妥钠、水合氯醛或异氟烷/氧气混合气体将大鼠麻醉，麻醉程度适中（麻太深，动物容易死亡，若麻太浅，动物可能会在手术过程中清醒，影响实验，建议有条件最好用气体麻醉装置持续给药，手术效果最好，而且动物死亡率最小）

2.  固定

1)  打开冷光源提供照明，将已麻醉的大鼠固定在脑立体定位注射仪上（我公司采用目前国际上最先进的全自动电脑定位仪：Stoelting 51700/51500，并加配机器手，如图A。通过最新的电脑软件控制，配合高清晰的3D脑图谱，可实现自动的、精确的脑立体定位，并能充分克服人为因素给实验带来的误差）；

图1.我公司所用的全自动脑立体定位系统

2)  固定头颅：先将一侧耳棒轻轻插入外耳道，碰到骨性外耳道底后固定耳棒，继之同样插入固定另一耳棒，检查大鼠头部固定是否稳定，松斜，两侧耳棒刻度是否对称，轻移耳棒使两侧刻度一致头位完全居中，再次固定耳棒；

3)  固定上颌： 将大鼠的上门牙塞进上齿固定板的槽内，旋紧螺丝。从各方向推压动物头部，均不应出现移动。通过定位针的测量调节前后囟在同一矢状线上，并使前囟(Bregma)和后囟(Lambda)尽量处于同一水平面上，检查是否固定好的标准主要有三个：鼻对正中、头部不动、提尾不掉，如图B；

图2.实验动物（以大鼠为例）固定在立体定位仪上

3.  钻孔

1)  将大鼠头部的毛用宠物剃毛刀剃掉，然后用医用酒精和碘酒对头部反复消毒，防止感染；

2)  将眼药膏抹在动物眼睛上，保持眼睛湿润，防止动物眼睛由于长时间处于干涩状态而失明；

3)  用医用剪刀小心地剪开从两眼间到两耳根间的头皮，如图C；

图3.将从两眼间到两耳根间的头皮剪开，暴露颅骨

4)  用止血钳将开口撑大，用手术刀刮掉颅骨表面硬脑膜（Dura），用棉签擦掉血迹，此时可以清楚看到Bregma和Lambda点的位置，如图D；

图4.Bregma点和Lambda点的位置图

5)  利用定位仪，保证前囟(Bregma，X=0,Y=0,Z=0)和后囟(Lambda)处于同一水平面上(X、Z值相差皆小于0.1)；

6)  &脑内核团定位，根据脑图谱，确定待注射脑区的位置参数，包含离Bregma和Lambda点的距离以及核团深度，例如内侧前额叶皮层(medial Prefrontal Cortex, mPFC)的位置是：Bregma向后1.96mm, 中线往左或往右0.42mm，Bregma向下1.62mm；

7)  利用定位仪找到要注射病毒的位置，用Marker笔或定位针在颅骨上做好标记；

8)  小心地用颅骨转在注射位点处轻磨颅骨，将颅骨慢慢打薄，当颅骨出现裂缝的时候，用医用注射器的针头小心挑破，防止损伤，如果在此过程中有出血，可以用很小的医药棉球拉成长条形将血吸走，钻孔时一定要控制好，否则很容易在钻通颅骨后一不小心钻头进入脑组织，造成损伤

4.  病毒注射

1)  用PBS冲洗微量注射器(5μl规格)3-5次；

2)  先吸取1μl空气，再吸取1μl稀释好的病毒(方便病毒充分注射进脑)，在空气中测试注射器是否通畅；

3)  将微量注射泵，微量注射器组装好，置于钻好的孔上方，针尖与颅骨平行(Z=0)，微调注射器位置使之与之前钻孔时位置相同；

4)  根据定好的深度将注射针缓慢下降，如图E；

图5.将注射针下至待注射脑区进行病毒注射

5)  以0.05μl/min的速度注射病毒，待还剩0.5μl时停止注射；

6)  注射完毕后，将注射针停留在注射位置10min待病毒扩散，然后缓慢提针；

7)  用PBS清洗微量注射器5次备用；

8)  注意注射过程中若有出血立刻用棉签吸走，以免带出病毒

5.  缝合

1)  注射针完全拔出来后将头皮缝合；

2)  实验结束后，将大鼠放在温度合适（25℃左右）的地方（如恒温加热板）恢复，等大鼠清醒即可放回笼子中

6.  检测病毒的表达

1)  慢病毒在注射5-7天后，即可用免疫组织化学实验检测表达情况，然后可以进行行为学分析（AAV的表达至少需要2周左右的时间，如图F）

图6.AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒在VGAT-Cre小鼠内侧前额叶皮层的表达（图来自于自我公司客户Science文章Ding Liuet al. Science346, 458 (2014); DOI: 10.1126/science.1256573）